Рис. 1. Схема противоопухолевого иммунного ответа. Т-клеточный ответ начинается с активации наивных Т-лимфоцитов, узнающих белок-мишень. Активированные клетки порождают Т-клетки, подобные клеткам памяти, которые могут самообновляться или порождать цитотоксические CD8+Т-клетки, способные уже непосредственно бороться с опухолью. В обсуждаемой работе было показано, что выключение гена Regnase-1 продлевает жизнь лимфоцитов внутри опухоли и увеличивает положительный эффект от них. Рисунок из популярного синопсиса к обсуждаемой статье в Nature
Один из иммунотерапевтических методов лечения рака, адаптивная клеточная терапия, заключается в том, что у больного забирают небольшую часть противораковых Т-лимфоцитов, размножают и активируют их в пробирке, а затем вводят обратно. Недостатком этого метода является то, что введенные лимфоциты вскоре погибают. В экспериментах на мышах удалось показать, что выключение гена, контролирующего белок REGNASE-1, во много раз повышает выживаемость лимфоцитов, увеличивает накопление их в опухоли и усиливает противоопухолевую активность. Инактивация генов Ptpn2 и Socs1 дополнительно усиливала эффект: развитие опухолей резко подавлялось, а мыши жили значительно дольше. Разработка лекарственных средств, подавляющих активность этих белков, станет значительным прорывом в иммунотерапии.
В настоящее время в распоряжении онкологов есть обширный арсенал средств для борьбы с раком. Это, например, и новейшие технологии, позволяющие делать точнейшие хирургические операции с минимизацией ущерба для организма, и различные условно неинвазивные методы — радиотерапия, химиотерапия, иммунотерапия. Радиотерапия основана на том, что воздействие ионизирующей радиации повреждает ДНК клеток и приводит к тому, что они теряют способность делиться или просто гибнут. При этом чем активнее делится клетка, тем вреднее для нее облучение. Поскольку раковые клетки обычно делятся гораздо активнее здоровых клеток организма, удается нанести большой вред опухоли, не слишком повреждая при этом здоровые ткани. В химиотерапии для борьбы с опухолями используются сильные клеточные яды, которые либо доставляются непосредственно к цели, либо спроектированы так, чтобы воздействовать преимущественно на раковые клетки. Несмотря на очевидный прогресс во этих методах, они имеют множество побочных эффектов и даже если и помогают победить болезнь (что, увы, происходит не всегда), сопровождаются сильным повреждением здоровых клеток и наносят сильный вред организму пациента. В отличие от них иммунотерапия характеризуется гораздо более высокой избирательностью действия, направленного на раковые клетки и опухоли.
В иммунотерапии можно выделить два основных подхода: иммунотерапию с помощью антител, направленных против специфичных для рака антигенов, и клеточную иммунотерапию с помощью иммунных лимфоцитов. Антитела (иммуноглобулины) распознают специфические для раковых клеток антигены и приводят к уничтожению злокачественных клеток — либо самостоятельно вызывая их апоптоз, либо привлекая другие компоненты иммунитета.
Клеточная терапия осуществляется с помощью иммунных лимфоцитов, которые можно разделить на три основных типа: В-лимфоциты, связанные с выработкой антител, NK-лимфоциты, относящиеся к врожденному иммунитету, а также Т-лимфоциты, участвующие в приобретенном иммунном ответе. Т-лимфоциты в свою очередь делятся на Т-хелперы, стимулирующие выработку антител и участвующие в презентировании антигенов, Т-супрессоры, регулирующие эти процессы, а также Т-киллеры или цитотоксические Т-клетки, задачей которых является уничтожение поврежденных и злокачественных клеток организма, а также чужеродных клеток. Т-киллеры — это основной компонент клеточного иммунитета, работающий в том числе и против раковых клеток. Т-лимфоциты формируются в тимусе, отсюда и буква «Т» в названии.
Разработка методов искусственного усиления противоракового иммунного ответа с помощью Т-лимфоцитов произвела настоящую революцию в лечении рака. Основу положили выполненные 30 лет назад пионерские работы Джеймса Эллисона и Тасуку Хондзё, за которые они получили Нобелевскую премию в 2018 году (см.: Нобелевская премия по физиологии и медицине — 2018, «Элементы», 04.10.2018).
Одним из подходов в иммунотерапии рака является так называемая адаптивная клеточная терапия (аdoptive cell therapy, ACT). В ответ на развитие раковой опухоли организм включает систему клеточного иммунитета. Один из компонентов этого иммунитета, Т-лимфоциты маркированные трансмембранным гликопротеином CD8, прямо связываются с раковыми клетками и убивают их (см., например, статью Точечное воздействие в иммунотерапии рака). Но часто силы собственных CD8+Т-клеток организма — их количества и активности — для борьбы с опухолью не хватает. Простейшая АСТ-терапия предусматривает выделение активированных лимфоцитов из крови или опухоли, размножение их in vitro и введение обратно пациенту. Такая процедура дает по крайней мере частичный эффект. С одной стороны, организм получает большое количество готовых к бою иммунных клеток, многие из которых успевают принести пользу. С другой стороны, искусственно разведенные CD8+Т-клетки встречают противодействие собственных механизмов самообороны опухоли и достаточно быстро погибают.
Как именно действуют защитные механизмы опухоли — толком не известно. Было выдвинуто предположение, что жизнеспособность CD8+Т-клеток зависит от каких-то особенностей их метаболизма (R. J. Kishton et al., 2017. Metabolic regulation of T cell longevity and function in tumor immunotherapy). Но от каких именно особенностей? Как эти особенности влияют? Всё это было абсолютно неизвестно. Методы адаптивной клеточной терапии постоянно совершенствуются и все более широко применяются в клинической практике. «Элементы» об этом неоднократно писали — см. ссылки в конце новости. Но важнейшая проблема нестабильности вновь вводимых противоопухолевых лимфоцитов остается нерешенной.
Некоторое время назад американские ученые провели исследование с целью установить, как влияют различные продукты и факторы метаболизма (ферменты, активаторы и ингибиторы транскрипции, а также транспортные белки) на противораковую активность CD8+Т-клеток. Основной идеей работы была инактивация генов, контролирующих интересующие ученых белки и ферменты, с последующим отслеживанием того, как эта инактивация повлияет на жизнеспособность Т-лимфоцитов. Современные методы геномной инженерии позволили выборочно инактивировать 3017 генов. Для этого авторы разработали элегантную систему, основанную на принципах CRISPR-Cas9-мутагенеза. Системы CRISPR-Cas9 в настоящее время широко используется в генно-инженерных исследованиях для модификации генов и редактирования геномов как в клетках эукариот, так и низших организмов (см. CRISPR gene editing, а также новость Систему CRISPR можно использовать для аккуратного встраивания генов в нужное место, «Элементы», 18.06.2019 и картинку дня CRISPR/Cas-системы).
Источником CD8+Т-клеток служила специально сконструированная линия мышей, в геном которых был встроен и экспрессировался ген Cas9, предназначенный для последующего мутагенеза. Таким мышам прививали клетки меланомы человека, и из сформировавшихся опухолей выделяли CD8+Т-лимфоциты. Эти клетки (несущие ген Cas9), размножали in vitro и проводили трансдукцию их библиотекой лентивирусов. Специально сконструированные лентивирусы позволяют наиболее эффективно вводить в клетки чужеродные гены. В данном случае лентивирусы вводили в CD8+Т-клетки индивидуальные гидовые РНК, каждая из которых была предназначена для инактивации одного из генов ферментов метаболизма, транспорта малых молекул или регуляторов транскрипции. Всего 9551 гидовая РНК была нацелена на 3017 генов.
После трансдукции CD8+Т-клетки вводили больным меланомой мышам, через 7 дней выделяли лимфоциты, инфильтрирующие опухоли, и сравнивали их с исходными с помощью секвенирования геномов с высоким покрытием (см. Coverage). При помощи такого секвенирования можно не только определить наличие тех или иных участков ДНК, но и оценить их количество сразу в большом наборе CD8+Т-клеток. Это позволяло отследить обогащение популяции CD8+Т-клеток определенными мутантными генами, происходившее за счет того, что лимфоциты с поврежденными жизненно важными генами не доживали до конца семидневного срока. Соответственно, среди оставшихся клеток можно поискать гены, работа которых после мутации улучшила выживаемость.
Анализ показал, что у лимфоцитов, инфильтрирующих опухоли, было сильно повреждено 218 генов, в том числе ряд известных регуляторов выживаемости и деления CD8+Т-клеток. Среди CD8+Т-клеток, выделенных из меланомы или из селезенки больных мышей, была особенно значительно повышена доля клеток с мутациями в гене Regnase-1. Ранее этот ген был обнаружен у млекопитающих, в том числе у человека, и был идентифицирован как фактор активации транскрипции, связанной с гибелью клеток. Было также известно, что кодируемый этим геном белок REGNASE-1 участвует в регуляции активации иммунных клеток, но его функция в противоопухолевом иммунитете была не ясна.
Авторы предположили, что белок REGNASE-1 является главным негативным регулятором Т-клеточного противоопухолевого иммунного ответа. Чтобы детально разобраться с эффектом выпадения функции белка REGNASE-1, исследователи трансдуцировали в меченые различными флюоресцирующими белками CD8+Т-клетки либо нейтральную гидовую РНК, либо гидовую РНК исключительно против гена Regnase-1. Клетки смешивали, подращивали и вводили мышам с меланомой. Через 7, 14 и 21 день определяли количество по-разному меченых клеток в селезенке и в опухолях животных. Оказалось, что количество CD8+Т-клеток с выключенным геном Regnase-1 превышало количество клеток с активным геном в тысячи раз (рис. 2, слева). Это означает, что Т-лимфоциты без белка REGNASE-1 более живучие и поэтому гораздо лучше способны накапливаться в опухоли и разрушать ее.
Рис. 2. Слева — Т-клетки, трансдуцированные лентивирусом с гидовой РНК против гена Regnase-1, накапливаются в опухоли (TIL, tumour-infiltrating lymphocyte) и в селезенке (spleen) в значительно больших количествах, чем контрольные клетки (они показаны черными и синими метками). В каждом случае указано, во сколько раз больше было клеток с отключенным геном Regnase-1. Справа — введение Т-лимфоцитов без белка REGNASE-1 повышает эффективность адаптивной клеточной терапии: замедляется рост опухоли (a) и повышается выживаемость мышей (b). Графики из обсуждаемой статьи в Nature
Эксперименты подтвердили такой вывод: после адаптивной клеточной терапии мышей оказалось, что введение клеток с выключенным геном Regnase-1 сильно замедляло рост солидных опухолей меланомы и повышало выживаемость животных (рис. 2, справа). Аналогичные эффекты наблюдались на и мышах, «зараженных» лейкемией.
Чтобы отследить процессы, на которые влияет ген Regnase-1, ученые провели сравнительное секвенирование РНК в клетках, в которых этот ген был выключен, и в клетках дикого типа. Клетки обоих типов выделяли из микроокружения меланом (то есть эти клеки непосредственно контактировали с опухолью) и из крови. В клетках с выключенным геном Regnase-1 из микроокружения набор РНК оказался смещенным в сторону, характерную для клеток памяти (формирующих быстрый вторичный иммунный ответ). Таким образом, отсутствие белка REGNASE-1 позволяет используемым для АТС лимфоцитам перепрограммироваться, накапливаться в микроокружении опухоли и долгое время оставаться активными, выполняя свою противоопухолевую функцию.
Вдохновленные принципиально новыми и важными как с теоретической, так и с практической точек зрения результатами, ученые постарались глубже понять механизмы перепрограммирования CD8+Т-клеток при дефиците белка REGNASE-1. Для этого они провели трансдукцию части CD8+Т-клеток лентивирусами, несущими гидовые РНК против REGNASE-1, а другую часть — лентивирусами, несущими гидовые РНК против практически всех генов мыши. Далее, после подращивания и активации, клетки смешивали и вводили в кровоток мышей с опухолями меланомы. Затем опять сравнивали отсеквенированные геномы клеток, полученных из окружения опухоли с геномами исходных клеток.
Клетки с выключенным геном Regnase-1, прошедшие через организм мыши, содержали больше активных генов Batf и меньше активных генов Ptpn2 и Socs1, чем исходные. Дополнительные эксперименты показали, что двойная инактивация Regnase-1 и Batf сокращает продолжительность жизни клеток, а инактивация Regnase-1 в сочетании с инактивированными Ptpn2 или Socs1 наоборот, усиливает накопление в опухоли CD8+Т-клеток и их противоопухолевую активность, а также продлевает им жизнь. Белок BATF является фактором регуляции транскрипции, активирует функции митохондрий и играет роль ключевого регулятора дифференцировки CD8+Т-клеток. Также уже было известно, что белок SOCS1 тормозит пролиферацию Т-клеток в культурах, а делеция гена Ptpn2 усиливает эффект иммунотерапии. Теперь же выяснилось, что комбинация инактивации гена Regnase-1 и инактивации хотя бы одного из генов Ptpn2 или Socs1 еще больше усиливает противоопухолевую активность CD8+Т-клеток.
Таким образом ученые установили, что белок REGNASE-1, участвующий в регуляции активации CD8+Т-клеток, является очень мощным и едва ли не главным негативным регулятором противоракового клеточного иммунного ответа. В результате выключения синтеза этого белка активность CD8+Т-клеток, применяемых для адаптивной противораковой иммунотерапии, может быть усилена во много раз. Такой эффект наблюдается как для солидных, так и для гематологических раков. Дополнительное выключение синтеза белков SOCS1 или PTPN2 усиливает эффект еще больше. Кроме того оказалось, что дефектные по REGNASE-1 клетки продуцируют гораздо больше цитотоксических белков (интерферона гамма, интерлейкина 2, фактора некроза опухолей) по сравнению с обычными Т-лимфоцитами. Причем это свойственно не только зрелым CD8+Т-клеткам, но и клеткам памяти, хотя в норме им это не характерно. Участвуют ли модифицированные клетки памяти в атаке на опухоль, пока неизвестно. И, главное, еще предстоит выяснить, как выключение гена Regnase-1 скажется на активности лимфоцитов против многих других отличных от меланомы опухолей. Но вряд ли эффект будет иным, так как механизмы клеточного противоопухолевого ответа в случаях различных раков весьма сходны.
Эти результаты выглядят очень многообещающими, хотя пока, конечно, до внедрения основанных на них методов лечения в практику еще далеко. Если удастся разработать средства, подавляющие активность соответствующих белков, то это будет настоящим прорывом в иммунотерапии рака.
Источник: elementy.ru
